Protein Data Bank 50年回顾（下五）：2003年诺奖水通道蛋白
1982化学奖：晶体电子显微学&核酸蛋白复合体 1988化学奖：膜蛋白结构&光合作用中心 1997化学奖：ATP的生物合成机理 & 钠钾泵 2003化学奖：水通道蛋白 aquaporin 2003化学奖：离子通道蛋白 ion channel 2006化学奖：真核转录的分子生物学机理 2009化学奖：核糖体结构 2012化学奖：GPCR 2013化学奖：复杂化学体系的分子建模 2017化学奖：冷冻电镜 2018化学奖：酶演化 2020化学奖：基因编辑 2020生理学医学奖：丙肝病毒
2003年的诺贝尔化学奖颁发给了约翰斯·霍普金斯大学的Peter Courtland Agre (1949 - ) 与洛克菲勒大学的 Roderick MacKinnon (1956 - )：前者发现了细胞膜上的水通道蛋白 (aquaporin)，后者则深入研究了细胞膜上的离子通道蛋白 (ion channel) 的结构与功能机理。
水通道蛋白为什么重要？因为水分在细胞和细胞器内外的输运是细胞生命活动的基石。大脑如何分泌和吸收脊髓液？泪液、唾液、汗液等等如何分泌？肾脏如何富集尿素？等等等等，无数生理过程涉及水分的跨膜输运。
因为水通道蛋白和离子通道蛋白都值得好好说一说，笔者决定将写两篇分别介绍两位诺奖得主：Agre（阿格雷）和MacKinnon，以及他们的工作。
本篇讲 Agre 与水通道蛋白。
目录：
家有学而年少无状
行医还是科研？
意外发现
证明猜想
1862年林肯颁布《宅地法》（Homestead Act），将美国中西部数百万英亩的印第安人的土地，以极低廉的价格授予自愿向西拓掠的欧洲移民。1880年前后，Peter Agre 的曾祖父母加入移民洪潮，从斯堪的纳维亚来到南达科他。
Peter Agre出生时，家族已经搬到了毗邻明尼苏达首府双子城的小镇 Northfield（北地）。北地镇汇集了大量来自挪威的北欧移民，Peter 回忆自己幼年时曾与小伙伴们挥舞着挪威国旗，夹道欢迎来访明尼阿波利斯的挪威国王哈康七世 (Haakon VII)。
Peter的父亲Courtland 先在北地镇上的 St. Olaf College 任化学系教授，后来又因为挪威路德宗的 Augsburg College 的化学系急缺教师而接受聘请，举家搬到明尼阿波利斯。得益于父亲在学术界的广泛人脉，Peter 年少时得以与许多大牛近距离交流，这其中最令小Peter印象深刻的是 Linus Pauling 在他们家住了一周！
Peter的青少年生活可谓无忧无虑，除了对父母之命不感兴趣，滑雪、骑行、泛舟无一不为，当然还有追女孩。高中第一年结束，Peter在俄语课老师的带领下参加了一趟前往苏联的旅行。归来的Peter不仅幻想自己是布尔什维克，而且嘲仿校报《标准》（Standard）在校内创办了小报《不标准》（Substandard）。
见识过1960年代中期的社会主义苏联的自由，经历着越战和麦卡锡主义造成的社会压抑，目睹着因黑人民权运动而泛涌的思潮，Peter通过创建地下报刊作出自己的小小反击。这差点让 Peter 被开除！当然，另一个差点让日后的化学诺贝尔奖得主不能高中毕业的原因是，他的化学课仅得了D。
Agre 与《不标准》
高中毕业后，Peter白天在明大修俄语，晚上在一家为越战生产地雷的兵工厂开大货车。这当然远不是什么理想的生活。
出路在哪呢？
父亲不是在大学教书呢么——Peter去了父亲任教的 Augsburg College 读化学，准备日后做医生。Peter的大姐Annetta、大弟Jim、三弟Mark均先后就读于Augsburg。
Agre 一家（1965）从左到右：Peter，父亲Courtland，大妹Ruth，母亲Ellen，幼弟Mark，大弟Paul，大姐Annetta，二弟Mark。
本科毕业后，Peter 进入约翰斯·霍普金斯大学（JHU）的医学院学医。他先在Brad Sack（1935 - 2017）的实验室纯化从大肠杆菌中分离的霍乱毒素（cholera toxin），之后到 Pedro Cuatrecasas（1936 - ）的实验室研究霍乱毒素的生物化学性质。—— 此时Peter接受的生化训练影响了他一生的研究。
毕竟 Peter 去JHU的目的是学医，离开巴尔的摩后，他在克利夫兰的凯斯西储大学（CWRU）校医院完成了临床训练（1975 - 1978）。尽管那段日子令人身心俱疲，Peter 很享受被他的黑人患者昵称为“jive doctor”。
Tommy Smalls (1926 – 1972) 是名噪一时的非洲裔电台摇滚乐DJ，他被称为 Dr. Jive（捷舞博士）。
接下来三年，Peter的人生轨迹发生了转折。
1978年，Peter追随JHU的导师Pedro Cuatrecasas来到北卡罗来纳，成为了北卡教堂山分校（UNC-Chapel Hill）的血液学与肿瘤学项目的研究员。因为生活拮据（Spartan），长女、次女接连出生，Peter不得不去学校附近的布拉德堡（Fort Bragg）兼职行医。
这时，Peter 的医学院博士室友 Vann Bennett 也来到了北卡从事血液学研究。Vann 发展了生化技术来研究血红细胞的细胞膜上的血影蛋白（spectrin），发现了锚定蛋白（ankyrin）；另一方面，UNC的一位儿童血液病医生，Campbell McMillan，发现了两例极其罕见的遗传性球形细胞增多症（hereditary spherocytosis），这是一种红细胞膜异常的遗传性溶血性贫血。
Peter 与 Vann 一道研究了这两个病例，发现患者红细胞膜上的血影蛋白严重不足。这项研究发表在了《新英格兰医学杂志》，极大地鼓励了Peter从事科研。
（左）患者的母亲体内健康的饼状血红细胞（SEM图像）；（右）患者体内病态的球状血红细胞。
科研需要正反馈，不断的正反馈——成功的完成科研项目，解决科研问题，发表好的文章，进而在精神上、经济上（科研资金）正向地促进科研工作者继续科研。
我想读这篇小文的许多朋友应该有这样的体会：中小学时做数理化题目，与几何代数斗其乐无穷，与电磁力学斗其乐无穷，与有机无机斗其乐无穷，题解三天得，一吟双泪流，一旦解决难题，兴趣和自信瞬间爆棚，更无反顾地去钻研更多更难的问题。
反过来，如果在科研过程中不断遭受沮挫，例如不能解决技术问题而项目卡壳，无法逾越思维障碍而徘徊，或者更糟糕地，完成了好的科研却无法发表到符合期待的刊物，那么科研信心必然受打击。这时能否坚持下去，或者还是否有坚持下去的必要，都说不好了。
Peter成功地解释，为何通常仅让患者稍微贫血的球形细胞增多症，在罕见的遗传情形下几乎能致死。这燃起了他的科研欲望。
1981年，好友 Vann 拿到了JHU的教职，Peter自愿降薪40%，回母校加入哥们的实验室做科研。
但是，人要靠钱活着，不能靠理想活着，对不对？
降薪40%，孩子怎么养？Peter 去了巴尔的摩钢铁工人大厅（Steelworkers’ Hall）作拳击赛的场外医生，挣钱补贴家用。
生活在曲折中前行。
1983年，Peter先后拿到哈佛医学院布莱根妇女医院血液学分部和JHU血液学分部的教职。然而，Peter在当年出生的三女却早产了。为了更好地照顾妻子和幼女，Peter决定留在JHU作教授。但女儿终于在年底夭折。
血液学研究究竟怎么联系到水离子通道的发现？就要来了——
JHU提供的实验室启动资金很有限。初期，Peter 仅能招收一名技术员，Andy Asimos。与Andy一起，Peter 自己实验室第一份重要的工作是进一步关联了血影蛋白与球形细胞增多症的关联。
随后，Peter与Asimos研究Rh血型系统（Rhesus blood group）抗原。他们希望将抗原注射入在兔子体内，产生抗体，分离出变性的多肽抗原，从中确定Rh抗原的组成。
Peter等人发现起初分离的部分纯化的约30kDa的多肽其实包含两种膜蛋白：一种约32kDa，一种约28kDa。
那时候已经有欧洲的研究组报道，在Rh(D)个体的红细胞内存在一种32kDa的蛋白。但是还没有研究组发现过那种28kDa的蛋白。
接着，Peter发现这种28kDa蛋白有如下特征：
大量存在于血红细胞的细胞膜上：每个血红细胞约含200000 个。
很有可能是四聚体膜蛋白：所以可能是孔道。
大量存在于人类肾脏内：广泛分布于肾小管和肾髓袢（loop of Henle）内。
所以，这个蛋白可能是啥玩意的孔道？
聪明如你，肯定猜到这个蛋白就是本文的主角：水通道蛋白。
当时，Peter问了十多位著名的生化学家、生理学家，没有一人推测出来。直到1991年，Peter的医学导师，John C. Parker（1935 – 1993）首先建议，这厮莫不是通水？——血红细胞和肾小管都超级透水啊！
现在要严谨地证明这个28kDa蛋白是水分子通道。
1. 证明广泛存在。
蛋白序列分析和DNA序列分析显示这种蛋白还广泛存在于诸如牛眼晶状体、果蝇大脑、细菌、植物等等。
2. 证明是水通道的一部分。
使用青蛙（非洲爪蟾，Xenopus laevis）的卵母細胞（Oocyte）来证明其可以跨膜运输水分子。青蛙的卵母细胞拥有非常低的透水率，即便将之放在纯水中，渗透压也不能使细胞破裂。
因此，对照组仅将水注射入卵母细胞（下图左侧细胞），实验组将2纳克的该蛋白的互补RNA（cRNA）连同水注射入卵母细胞（下图右侧细胞）。
接着，研究者将两个卵母细胞都转移到相对低渗的纯水中，对照组因为低透水率几乎无变化，实验组却不断吸水以致于涨破。
至此，Peter Agre证明了水通道蛋白的确存在！这种28kDa蛋白被命名为 aquaporin-1（AQP1）。
现在剩下最后一个问题：必须要证明AQP1就是水通道蛋白本身，而不是使（卵母）细胞膜上的水通道蛋白发挥功能的调节蛋白质。
3. 证明是水通道，而不是水通道调节蛋白。
首先，Peter 与JHU的 Suresh Ambudkar 将纯化后的AQP1加入人工合成的脂囊泡（这样就不含有其它蛋白质了）。
接着，Peter再与丹麦奥胡斯大学的 Arvid Maunsbach 合作，用冰冻断裂电子显微镜查验加入和未加入AQP1的脂囊泡，发现未加入AQP1的脂囊泡表面光滑，加入的膜表面存在许多粒径约10纳米的颗粒。
然后，Peter与哈佛医学院的 Mark Zeidel 合作，证明加入的AQP1的确可以透过水分，令脂囊泡加速收缩（增大了脂囊泡的透水率）。
这样，Peter与合作者们就完全证明AQP1自身就是水通道。
Aquaporin的结构：沙漏状单体（左），四聚体（右）。Cells 8(2):82
大家说说，因为研究贫血症而发现水通道膜蛋白，是走了什么运？Peter自己说这是 sheer blind luck。我把它翻译为“狗屎运”，大家反对吗？
可是如果没有Peter宁愿自降薪水也要科研，宁愿下班后去夜间拳场驻医也要科研，哪有什么运气？
Peter Agre与实验室组员（左）；与家人（右）。
参考资料
Agre, Aquaporin Water Channels (Nobel Lecture)
Maria Blackburn, Good Chemistry, Johns Hopkins Magazine
Paul B. Rothman, Introduction of Peter Agre, J. Clin. Invest. 2016; 126(12):4735–4741.
Agre et al., N Engl J Med 1982; 306:1155-1161
Gheorghe Benga, Birth of water channel proteins—the aquaporins, Cell Biol. Intern. 27 (2003) 701–709