前言：
If it can happen it will happen.本周（2022.6.29）Science 杂志发了一篇新闻稿，报道新冠病毒针对辉瑞的新冠“神药” Paxlovid 出现了新的耐药突变。—— 这种事，不奇怪吧。设计和验证时，Paxlovid 对阿种、贝种、德种、伽种、兰种、奥种都有效，冤种来了，逐渐失效——放任感染的必然结果。君不见，福奇四针加强两服神药又复阳？本不想多看这种新闻，奈何配图实在太好看了（就是下图）！堪称蛋白质画图界的迪丽热巴！小王因此通读了这篇新闻，觉得其报道的几项最新研究值得分享。
doi: 10.1126/science.add7226这篇新闻报道提到了4篇最新的bioRxiv上的预印本论文，来自于四个国家的不同研究机构的不同领域的课题组：- 比利时天主教鲁汶大学，病毒学家 Dirk Jochmans
- 丹麦哥本哈根大学，免疫学家 Judith Margarete Gottwein
- 美国加州大学河滨分校，生物信息学家 Adam Godzik
这四个研究团队从不同角度论证了同一件事：Paxlovid 的耐药性来源于新冠病毒 3CL MPro 蛋白发生了突变，蛋白与药物小分子的结合位点位于酶活催化的口袋内，在保持蛋白的酶活基本不变的情况下，MPro 蛋白在166等位点发生突变可以显著降低 Paxlovid 的药效。比利时研究组开展了体外细胞实验，利用 3CL 靶点抑制剂 ALG-097161去诱导新冠病毒突变，通过不断增加剂量，获得耐受抑制剂的剂量更高的突变体。研究者发现，使用这种抑制剂诱导而获得的高耐受突变体，对 Paxlovid 的活性成分 nirmatrelvir 也有高耐受性，使药效降低了20倍。
下图的纵轴是添加抑制剂的浓度（以微摩为单位），横轴是时间（以天为单位）。增加抑制剂浓度，不断筛选耐受性增强的突变体，在实验尾端获得了含有三个突变位点的突变体，突变位点是 L50F + E166A + L167F。
耐药性增高伴随有蛋白酶活的降低，含有三个位点突变的突变体蛋白的酶活仅仅是野生型的 5.3%。那么，这种在实验中诱导获得的突变体病毒可能不会造成大流行。丹麦团队分析了截至2022.4.18的全球流感共享数据库（GISAID），统计与 nirmatrelvir 耐药性有关的 Mpro 蛋白的突变体，找到概率最高的突变体。研究者发现，突变体 L50F/E166V 可以产生80倍的耐药性。
不同于比利时团队的研究，GISAID 内的病毒序列都是从真实世界采集的，不是在实验室内诱导产生的。换句话说，丹麦团队发现的耐药突变体都曾经在或者正在某地传播着。此项研究的目的在于通过 GISAID 的实时更新数据”监控“正在全球各地流行的各种病毒突变体的耐药性突变。研究者还考虑了 nirmatrelvir + remdesivir（人民的希望）的组合使用效果，发现 remdesivir 联用能增加对耐药突变体的杀伤。换句话说，两种药物的联用可能有更好的疗效。这也不奇怪，治疗艾滋需要三种或更多的抗病毒药联用，鸡尾酒嘛。
野生型（左上）、单位点突变体L50F（右上）、单位点突变体E166V（左下）、双位点突变体L50F/E166V（右下）
美国加州大学河滨分校的研究原创性低，没啥意思。基本和丹麦团队做得一样，统计 GISAID 中耐药突变体的出现概率。没有基于结构的分析，也没有基于实验的分析，仅仅基于对数据库的统计。好歹丹麦人还做了分子动力学模拟呢。
加州团队做了一个在线服务器 conronavirus3D server，专注于 GISAID 中针对 Mpro 或 PLpro 蛋白所设计的小分子药的耐药突变体。这有点抢跑的意思，因为针对 Mpro 已经上市了 Paxlovid（活性成分 nirmatrelvir），针对 PLpro 还没有药物上市。通过分析统计数据，研究者发现，涉及 Mpro 催化反应活性中心的突变非常罕见 —— 这当然是因为这类会显著影响酶活；在活性中心边缘的突变则比较常见，其一方面较小地影响酶活口袋，另一方面能影响与药物小分子的结合。
美国罗特格斯大学王俊团队同样扫描了 GISAID 数据库，考虑 nirmatrelvir 与 Mpro 蛋白的结合，将所有与结合的 nirmatrelvir 相距6 Å 以内的残基的突变纳入研究范围，利用大肠杆菌表达突变基因，比对突变体病毒的耐药性和活性。
研究者从66个突变体中找到了11个保持了酶活，其中的5个有较强的耐药性（至少10倍）。这5个突变体涉及的突变位点包括 144、165、166、172、192，其中 166 是前几项研究都识别了的。11个保持了酶活的突变体包含的突变是：S144M/F/A/G/Y, M165T, E166Q, H172Q/F, Q192T/S/V。- H41 & H163 对保持酶活极为关键，其中 H41 与 C145 形成catalytic dyad。含有这两个残基突变的病毒不太可能形成传播。
- S144, M165, E166, H172, Q192 是耐药性突变的高发位点。
- S144 位于 S1 口袋，是 oxyanion hole 的一部分；
- M165 位于 S2 口袋，与二甲基环丙基脯氨酸，形成疏水相互作用；
- E166 位于 S1 口袋，与 nirmatrelvir 形成3个氢键；
- H172 位于 S1 口袋，与 nirmatrelvir 不直接相互作用；
- Q192 位于 S4 口袋，与 nirmatrelvir 的三氟甲基形成疏水相互作用。
- M49, T135, N142, H164, M165, Q189 能耐受多种突变，且不会明显影响酶活和药物小分子的抑制作用。
- H172Y 单位点突变降低了酶活（降低13.9倍），Q189E单位点突变增加了酶活（增加1.9倍），H172Y/Q189E 双位点突变保持了酶活（增加1.3倍），并且相较 H172Y 单位点突变，有更强的耐药性。—— 这意味着，尽管单位点突变会降低蛋白的活性，但是多个位点的突变可能补偿酶活损失，甚至增加酶活，同时拥有耐药性。
这项工作很有意义 —— 因为研究者不仅考察了各个突变体的耐药性，而且考察了各个突变体的活性。那些基本不会降低活性然而却能大幅提高耐药性的突变体，最可能造成新一波大流行。更糟糕的是，增加 Paxlovid 的使用，而不抑制病毒传播，会对病毒突变形成新的选择压，增加耐药突变体的出现。
Mpro 蛋白所有与结合的 nirmatrelvir 距离 6 Å 以内的残基：H41, M49, T135, N142, S144, H163, H164, M165, E166, H172, Q189, Q192。
冠状病毒的 3CL Mpro 蛋白的序列高度保守，MERS, SARS, SARS-CoV-19 等病毒的 Mpro 蛋白的序列差异非常小。这说明，Mpro 蛋白的突变体令病毒不易存活或传播。
新冠病毒的 3CL Mpro 蛋白的三维结构，右侧是酶活催化中心。
MERS, SARS, SARS-CoV-19 等病毒的 Mpro 蛋白的多序列比对。小王在自己的朋友圈分享迪丽热巴蛋白图时，依然忍耐不住，讽刺辉瑞神药对结束大流行无用：医保进这个药，2300块一盒，不是冤种了么。
公共防疫的最大倚仗永远是 NPI（非药物干预）：控制传染源、切断传播途径、保护易感人群。香港的本轮奥种疫情已经过去，上海也已经动态清零，然而台湾，病毒却正在肆虐。已经两个多月了！仅昨天，7月2号，台湾新增确诊34827例，死亡96例。死亡高龄老人，有人出来说这些病故的老者有基础病，年龄也超过了平均寿命，残酷的逻辑。大家注意到吗，台湾省在这两个月死了20个12岁以下的孩子。疫情没有过去！然而，上海封城时嚣嚷的自媒体们面对台湾，现在全都寂静了，可见他们并不真正关心同胞的死活。
[1] doi.org/10.1101/2022.06.07.495116[2] doi.org/10.1101/2022.06.06.494921[3] doi.org/10.1101/2022.05.27.493798[4] doi.org/10.1101/2022.06.28.497978[5] doi.org/10.1038/s41467-020-16954-7[6] doi.org/10.1002/med.21783[7] doi.org/10.1016/j.bmcl.2020.127377生医行业观察
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